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NEB無縫克隆
——同源重組Gibson組裝、Golden Gate 組裝

 
北京澤平代理的美國進口NEB無縫克隆產品，提供基于同源重組Gibson組裝（吉布森組裝）的NEBuilder高保真無縫克隆試劑盒（含核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶），以及基于Golden Gate 組裝（金門組裝）的NEBridge無縫克隆試劑盒（BsaI-HFv2、BsmBI-v2）、50種IIS型限制性內切酶、T4 DNA連接酶等，支持≤52個片段的無縫組裝，具備高組裝效率、高靈活性，支持復雜DNA片段克隆，為生物實驗分子克隆提供高性能的研究工具。




一、NEBuilder Gibson組裝

NEBuilder無縫克隆技術，是對同源重組技術（即Gibson組裝、吉布森組裝）的升級，在待插入片段末端通過PCR擴增添加15~30bp重疊序列，在等溫條件下，通過5'外切酶消化形成3'突出粘性末端，同源重組互補退火，高保真DNA聚合酶進行延伸，高保真DNA連接酶補平缺口，可實現≤11個片段的高效無縫組裝，特別適合單鏈寡核苷酸ssOligo塔橋、文庫構建、微型高通量克隆等應用。




 
NEBuilder擁有＞10年的開發應用經驗，性能指標嚴格，保證數據實現，具備高組裝效率、高保真度，即可解決復雜的高端克隆應用，也可節省常規克隆后續篩選時間。

1、不依賴內切酶——只需在多個片段末端添加重疊序列，僅質粒載體線性化時需要酶切，不受限制性內切酶所限，具備更大靈活性。

2、高組裝效率——支持≤11個片段的無縫組裝。

3、高保真度——使用高保真DNA聚合酶，即使5'末端、3'末端存在錯配，高保真DNA聚合酶可在退火后切割去除錯配序列（＜10nt），組裝正確性高，無需反復篩選、測序。

4、兼容性強——支持＜100bp片段、＞10kb片段、低起始量組裝，可使用合成的單鏈寡核苷酸ssOligo連接2條雙鏈片段（如插入接頭、gRNA文庫）。

5、方便快速——只需15min、在同一管中即可完成無縫克隆。

6、設計工具——提供NEBuilder.neb.com 在線設計軟件，可以方便、快捷地進行NEBuilder組裝引物設計，以獲得高效率、高正確性的無縫組裝。

 

 
二、NEBridge Golden Gate 組裝

用于無縫克隆的Golden Gate 組裝技術（金門組裝技術），在dsDNA片段兩端通過PCR擴增添加IIS型限制性內切酶識別位點，經IIS內切酶酶切后，識別位點被移除，形成互補的4堿基突出末端，再使用T4 DNA 連接酶進行連接，可將多個DNA片段插入載體中， 實現兩個片段、或多個片段的克隆，且克隆后無額外堿基的插入。

NEBridge Golden Gate 組裝試劑，對傳統技術進行升級，成功實現≤52個片段的高效組裝，提供包括成品Golden Gate 試劑盒、50種IIS型限制性內切酶、連接酶預混液（添加了連接增強劑）、經典T4 DNA 連接酶等產品，幫助研究者快速構建重組質粒。


以IIS型限制性內切酶BsaI-HFv2為例，進行Golden Gate 組裝時，需要在dsDNA片段的兩端加上其識別位點（GGTCTC）。酶切后，識別位點被移除，組裝片段末端帶有設計好的特定4堿基突出以指導組裝。


1、高組裝效率——支持≤52個片段的高效組裝，具備非常高的組裝效率和組裝準確率，其中＜30個片段的組裝效果更佳。


對于包含12、24、35、52個片段的Golden Gate 組裝反應，顯示了含有正確組裝的菌落百分比。誤差線為至少3個重復的標準差。以下幾篇文獻對此進行了報道：

1. Pryor, J.M., et al. (2022) ACS Synth. Biol. e0525
2. Pryor, J. M. et al. (2020). PLoS One, e8592
3. Potapov, V. et al. (2018). ACS Synth. Biol., e0333 

 
2、豐富IIS型內切酶——NEB提供業內更多的50種IIS型限制性內切酶，其中9種酶經過Golden Gate 組裝驗證，提供了更多酶切位點選擇。
 

 
3、高兼容性——支持高GC含量、高重復序列、＜100bp片段、＞15kb片段的復雜組裝。

4、高保真度——NEB經典T4連接酶，通過高保真末端連接，提高復雜多片段組裝的正確性（20個片段組裝正確率＞90%）；升級的NEBridge連接酶預混液，對緩沖液體系、操作步驟進行優化，搭配NEB IIS型內切酶使用，可進一步提高連接效率和保真度。


圖. 使用NEBridge連接酶預混液進行24個片段的Golden Gate 組裝。使用NEBridge連接酶預混液時，每微克載體DNA產生2.2±0.2*10⁶個正確組裝的菌落，保真度為94.3±1%，而使用NEB T4 DNA 連接酶緩沖液時，每微克載體DNA產生8.3±2.1*10⁵個正確組裝的菌落，保真度為69.8±10.7%。


5、使用靈活——提供Golden Gate 組裝試劑盒（BsaI-HFv2、BsmBI-v2）、50種IIS型限制性內切酶、NEBridge連接酶預混液、T4 DNA 連接酶等豐富產品形式，供實驗人員靈活使用。

6、操作簡單——酶切和連接反應可在同一管中完成，簡化實驗步驟。

7、設計工具——提供GoldenGate.neb.com 在線設計軟件，可以方便、快捷地進行Golden Gate 組裝引物設計，通過預測、評估粘性末端鏈接偏好，實現復雜片段的高保真組裝。

 
 

DNA組裝選擇

 

 
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